人溶菌酶密码子优化及其在牛乳腺细胞中高效表达

【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子（LYZop22）和全局密码子(LYZop)分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体（pGL3-LYZcw/op22/op）和人溶菌酶过表达载体（pcDNA-LYZcw/op22/op）,将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞（BFFC）和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异。依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子（RSCU>1.5）和7个低频密码子（RSCU<0.5）对人溶菌酶基因密码子进行优化并转染多种细胞进行表达效果分析。荧光素酶分析发现,相比野生型溶菌酶密码子（LYZcw）,翻译起始区密码子优化类型LYZop22分别在BMEC、BFFC细胞中提高1.48倍（P<0.01）和1.30倍（P>0.05）;而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍（P<0.01）和2.44倍（P<0.01）,说明密码子优化能明显提高人溶菌酶在多种细胞中表达量。实时荧光定量PCR结果表明,LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC细胞中分别提高了2.08倍（P<0.05）和1.5倍（P>0.05）,而LYZop则分别提高了22倍（P<0.01）和17.8倍（P<0.01）,mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关。Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量。上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果。【结论】通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础。     

A data transfer method for improving seed identification of maize (Zea mays) haploid breeding based on genetic similarity

Maize haploid breeding technology is able to identify haploid seeds non‐destructively, rapidly and at low cost with the help of Near‐infrared (NIR) spectral analysis. However, due to the hybridization of numerous parents and the low production rate of haploid, the haploid data collection becomes a burden for engineering this technology. Biologically, there are considerable similarities between the progeny of the same female parent and different male parents. Based on this advantage, similar spectral data can be transferred when the NIR technology is employed. A revised method of Transfer adaptive boost (TrAdaBoost) is proposed to improve identifying for the backpropagation neural network (BPNN) classifier. To avoid the negative transfer, a screening thresh is used to select out similar data, and the amount of these data are limited to join current training. The results show that the identification performances are improved significantly when the data amount is small. This method shows a high ability to make the seed identification more convenient for engineering maize haploid breeding.     

陆地棉新品种生物学特性与品质特性鉴定结果分析

对2016-2017年引进的62个陆地棉新品种进行了形态特征、生物学特性和品质特性的鉴定及分析。结果表明：目前收集的新材料以中早熟棉为主,铃重以中等大小为主,衣分中等,悬殊较大,马克隆数值普遍偏大。     

竹花叶病毒浙江麻竹分离物全基因组序列及siRNA分析

正已知有3种病毒可在自然条件下侵染竹类植物,即竹花叶病毒(bamboo mosaic virus,BaMV)~[1]、樱桃坏死锈斑驳病毒(cherry necrotic rusty mottle virus,CNRMV)和苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)~[2,3]。其中,BaMV是最早在巴西的金竹(Bambusa vulgaris Cv.)和孝顺竹     

基于形态学及多基因位点的枸杞褐斑病病原鉴定

枸杞Lycium barbarum Mill.是一种药食两用的名贵中药材,褐斑病是2010年在甘肃省枸杞种植区发生的由无性态类真菌新种枸杞小黑梨孢Stigmella lycii引起的新病害,据2015年-2018年调查,该病害已扩展至甘肃省各枸杞种植区,常年发病率45%～65%,严重度2～3级。本研究首次对枸杞小黑梨孢有性态形态进行描述,并结合分子生物学方法,确定该病病原菌的系统发育地位,为该病的防治提供一定的理论依据。枸杞褐斑病菌在离体培养条件下和越冬病叶上均可形成有性态。子囊壳球形至亚球形,大小185.6μm×176.6μm,有喙,喙的大小为(35.7～53.6)μm×(32.0～53.55)μm;子囊袋状,大小(103.2～165.7)μm×(15.7～22.4)μm,含8个子囊孢子;子囊孢子砖格状,大小(25.9～36.5)μm×(9.4～14.1)μm,平均31.2μm×12.3μm,具(4～)6～7个纵隔和1～3个横隔。通过ITS、LSU、RPB2和EF1-α多基因位点联合构建系统发育树,确定该菌为子囊菌门格孢腔菌目格孢腔菌科真菌。秋末冬初清洁田园,减少来年初侵染源,是有效防治枸杞褐斑病的关键措施。     

不同林龄湿地松林土壤酶活性与土壤养分特征

以大鹤国有防护林场3种不同林龄(15、23、34 a)的湿地松林为研究对象,研究了不同林龄湿地松林土壤酶活性及其养分含量变化特征。结果表明:土壤pH值随着林龄增加呈先降低后升高,随着土层深度的增加逐渐升高。随着林龄的增长,土壤有机质先增加后降低;土壤水解氮、有效磷和速效钾含量逐渐降低。土壤中的脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶活性随林龄的增长逐渐降低;酸性磷酸酶活性仅在表层土随着林龄的增长逐渐降低,而随着土层的加深表现为先增长后降低。土壤养分和酶活性随土层深度的变化均存在显著性变化。相关分析表明,土壤脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶均与土壤有机质、水解氮、有效磷和速效钾存在极显著正相关(P<0.01),多酚氧化酶与速效钾呈显著负相关(P<0.05)。滨海地区湿地松在林龄较低阶段土壤养分较为充足,随着林龄的增长,土壤肥力逐渐下降,不利于森林可持续发展。     

大花君子兰叶绿体基因组及其特征

采用Illumina MiSeq测序平台对大花君子兰（Clivia miniata）叶片总DNA进行测序，通过组装获得了其叶绿体基因组（cpDNA）全长序列（158 114 bp）。对其cpDNA注释得到135个基因，包含87个蛋白编码基因、40个tRNA基因和8个rRNA基因。采用生物信息学方法对获得的cpDNA进行简单序列重复（SSR）分析和密码子偏好性分析。结果显示：①大花君子兰cpDNA中共有61个SSR位点，其中单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复数分别为38、9、2、8、3和1个，多数SSR分布在基因间隔区；②大花君子兰cpDNA密码子偏爱以A或U（T）结尾，亮氨酸使用频率最高，半胱氨酸使用频率最低。基于24种植物的cpDNA全长和23种植物的叶绿体ycf2基因序列进行系统发育分析，结果显示大花君子兰与石蒜科植物在同一分支，显示最近的亲缘关系，支持大花君子兰属于石蒜科。基于叶绿体ycf2的系统发育分析结果与基于cpDNA全长的系统发育分析研究结果大部分相同，支持ycf2基因可以代替cpDNA全长用于植物系统发育分析。     

苦瓜种子大小和单粒质量的遗传分析

以苦瓜自交系K7-359(P_1)和K7-422(P_2)分别作为母本和父本,通过杂交获得F_1,F_1自交获得F_2群体,采用主基因+多基因混合遗传模型分析苦瓜种子长度、宽度和单粒质量的遗传规律。结果表明,苦瓜种子长度和单粒质量的遗传均符合加性-显性-上位性多基因遗传模型(C-0模型),多基因遗传率分别为84.91%和76.55%,说明对苦瓜种子长度和单粒质量的选择宜在高世代进行;苦瓜种子宽度的遗传符合1对加性-显性主基因+加性-显性-上位性多基因模型(D-0模型),主基因和多基因遗传率分别为79.30%和3.86%,主基因遗传效应主要以加性效应为主,说明对种子宽度的改良可以采用组合育种的策略,且适宜在早期世代进行选择。     

胡葱黄条病毒吉林毛葱分离物全基因组序列测定与分析

使用RT-PCR方法从吉林省疑似感染胡葱黄条病毒(Shallot yellow stripe virus,SYSV)的分蘖洋葱(毛葱)叶片中获得了SYSV吉林毛葱分离物SYSV-JL(MN607702)的全基因组序列。SYSV-JL的全长序列为10?427 nt,与GenBank已登录的3条SYSV全长或近全长序列在多个基因上保持着较高的序列一致性,但在P1基因上核苷酸和氨基酸序列一致性较低,分别为69.5%～84.2%和60.9%～76.9%,进一步通过变异分析发现,P1基因包含369个变异位点,表现出较为明显的高变异特征。系统发育分析显示,不同SYSV分离物具有较为明显的地区差异,SYSV-JL分离物与多个中国分离物系统发育关系较近。     

瑞昌山药遗传多样性及块茎品质变异分析

瑞昌山药是江西省地方名优山药品种,由于长期进行无性繁殖和种植户自留种,品种混杂退化严重,极大影响了瑞昌山药资源保护和可持续利用。对从瑞昌市不同产地收集的12份栽培种和2份野生种瑞昌山药资源进行遗传多样性和块茎营养品质分析。结果表明,12对SRAP引物和11对SSR引物在所有材料中共扩增出50条多态性条带。不同产地材料间存在一定的遗传差异,遗传相似系数在0.415～0.964之间。UPGMA聚类分析表明,当遗传相似系数为0.530时,可将14份瑞昌山药材料分为两类,第Ⅰ类包括12份栽培种,第Ⅱ类包括2份野生种;当遗传系数为0.735时,可将12份栽培种分为3个亚类。品质分析结果表明,不同产地瑞昌山药材料品质指标间的变异系数差异较大,其中纤维素的变化范围最大,变异系数为54.28%,还原性糖的变异系数最小。主成分分析结果表明,瑞昌夏畈镇产地的山药品质较优,适于进一步系统选优和提纯复壮。